La diffusione del cristianesimo a Palestrina dovette essere sollecita, considerando che già nel 274 è attestato il martirio di Agapito, adolescente nativo del luogo, decapitato per ordine dell’imperatore Aureliano (270-275) nell’area dove sorgerà poi la cattedrale a lui dedicata. Il Lanzoni si discosta da tale ricostruzione e individua il luogo del martirio fuori dell’antica Preneste, inter duas columnas. La sua deposizione sarebbe avvenuta fuori del centro di Preneste, nella basilica suburbana delle Quadrelle, in un’area cimiteriale; le spoglie sarebbero state trasferite nella basilica urbana soltanto alla fine del IX sec.. In località San Quirico presso Paliano (XXXVI miglio della via Prenestina) è stato rinvenuto un antico cimitero cristiano sotterraneo con loculi e formae chiusi da tegole ascrivibili al IV sec.. Il primo vescovo citato dalle fonti è Secondo o Secondino, presente al concilio Romano di papa Milziade (311-314) del 313 (PL VIII 747). La successiva attestazione risale al 465, quando risulta vescovo un certo Gennaro (Ianuarius); a partire da questa data la lista episcopale diviene continua: vi figurano i vescovi Romolo o Romano (494), Sergio (679), Gregorio (767; consacra l’antipapa Costantino, con lui inizia la serie dei cardinali-vescovi), Costantino (826; stando al Liber Pontificalis avrebbe consacrato la basilica di Sant’Agapito).
II - Epoca medievale
In questo periodo vennero eletti pontefici due vescovi prenestini: Clemente III (1187-1191) e Niccolò IV (1288-1292). Un episodio particolarmente difficile per la storia della città fu lo scontro fra papa Bonifacio VIII (1294- 1303) e i cardinali della famiglia Colonna, Giacomo e Pietro, rispettivamente zio e nipote; la rottura fu così profonda che il pontefice emanò la bolla di crociata con indulgenza per chi si fosse sollevato contro Palestrina e i Colonna, giungendo alla scomunica e alla confisca dei loro beni. La città fu rasa al suolo e distrutta fino alle fondamenta (1298); l’aratro solcò le rovine dei palazzi e per completare l’opera fu sparso il sale: soltanto la cattedrale fu risparmiata. Bonifacio VIII dispose l’edificazione di una nuova città più a valle, Civitas Papalis, trasferendovi perfino la titolarità della sede cardinalizia. Clemente V (1305-1314) nel 1306 assolse la famiglia Colonna e la reintegrò nei suoi diritti; la città venne riedificata e il vescovo riassunse il titolo tradizionale.
III - Epoca moderna
L’epoca moderna corrisponde, nella storia della città e della diocesi, a un periodo di grosse calamità e distruzioni: così nel 1437 a opera di Giovanni Vitelleschi, nel 1527 dalle truppe di Carlo V, nel 1556 dal duca d’Alba. Niccolò V (1447-1455), che fece riedificare la città, restituì pure alla cattedrale i suoi antichi privilegi. Il 1630 vide, da parte della famiglia Colonna, la vendita della città e della diocesi alla famiglia Barberini per circa 775.000 scudi; l’acquirente fu Carlo Barberini, fratello del papa Urbano VIII (1623-1644), che il 19 ottobre visitò Palestrina, celebrò in cattedrale, visitò il monastero delle clarisse e gli altri conventi.
IV - Epoca contemporanea
L’ultimo cardinale-vescovo residenziale fu Benedetto Aloisi Masella (1947-1966). Già dal 1962 il beato Giovanni XXIII con il motu proprio De Suburbicarium Dioecesium regimine aveva stabilito che il vescovo residenziale non fosse più cardinale; di conseguenza, nel 1966 Aloisi Masella rinunciò al governo della diocesi, ritenendo solo il titolo: gli successe nel governo pleno iure il suo ausiliare Pietro Severi. Dopo la morte del cardinale Aloisi Masella, il titolo passò dapprima a Carlo Confalonieri (1970-1986), quindi a Bernardin Gantin (1986).
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